技术流程图:


固定-脱水-渗透-包埋-修块-切片-染色-TEM


细胞、细菌等样品:

1. 固定

1)前固定:收集样品,缓冲液冲洗后加入 2.5%戊二醛缓冲固定液(电镜品质),4℃ 固定 2 小时以上,最好过夜;

2)冲洗:缓冲液冲洗3次,每次5-9分钟,水洗1次,7-10分钟;

3)后固定:向样品中加入1%2%四氧化锇固定液进行后固定, 4℃固定1-3小时;

4)冲洗:缓冲液冲洗3次,每次5-9分钟。

2. 脱水

30%——50%——70%——80%——90%——100%——100%酒精对样品进行梯度脱水, 每步5-10分钟,为保证脱水完全,100%酒精重复2-3次。

3. 渗透(根据环氧树脂的品种,严格按配方比例混合并搅拌均匀)

丙酮置换样品中酒精,5-10分钟;

然后进行环氧树脂的渗透,每步比例与时间分别为:

丙酮:环氧树脂= 3:11-3小时(室温)

丙酮:环氧树脂= 1:11-3小时(室温)

丙酮:环氧树脂= 1:33小时-过夜(室温)

环氧树脂 100% 12-24小时(室温)

以上各步都在旋转混合仪上进行摇晃旋转,以加速渗透。

4. 包埋与聚合

1)包埋液的配制:向100%环氧树脂中加入1.5%-2%的催化剂,混合后搅拌20-30分钟;

2)样品的放置:树脂注入包埋模具或胶囊中,再将样品按所需的方位摆放在包埋模具或胶囊的树脂中,样品一定要放置在底部,防止聚合过程中移动;

3)聚合:45℃预聚合12小时,然后60℃聚合24小时。

5. 切片(略)

6. 染色(略)

植物组织(叶片、茎、根等)与真菌:

1. 固定

1)前固定:采集样品,缓冲液冲洗后,将样品放入2.5% 戊二醛缓冲固定液(电镜纯度)中。样品抽真空让其沉入固定液,确保固定液充分进入细胞,4℃固定过夜;

2)冲洗:缓冲液冲洗3次,每次5-9分钟,水洗1次,7-10分钟;

3)后固定:向样品中加入1%2%四氧化锇固定液进行后固定, 室温或4℃固定3-4小时;

4)冲洗:缓冲液冲洗3次,每次5-9分钟。

2. 脱水

30%——50%——70%——80%——90%——100%——100%酒精对样品进行梯度脱水, 每步20-30分钟,为保证脱水完全,100%酒精重复2-3次。

3. 渗透(根据环氧树脂的品种,严格按配方比例混合并搅拌均匀)

丙酮置换样品中酒精,20-30分钟;

然后进行环氧树脂的渗透,每步比例与时间分别为:

丙酮:环氧树脂= 3:13小时(室温)

丙酮:环氧树脂= 1:13小时(室温)

丙酮:环氧树脂= 1:33小时-过夜(室温)

环氧树脂 100%24-72小时(室温)

以上各步都在旋转混合仪上进行摇晃旋转,以加速渗透。

4. 包埋与聚合

1)包埋液的配制:向100%环氧树脂中加入1.5%-2%的催化剂,混合后搅拌20-30分钟;

2)样品的放置:树脂注入包埋模具或胶囊中,再将样品按所需的方位摆放在包埋模具或胶囊的树脂中,样品一定要放置在底部,防止聚合过程中移动;

3)聚合:45℃预聚合12小时,然后60℃聚合24小时(Spurr树脂70℃聚合24小时)。

5.切片(略)

6.染色(略)

活体动物组织:

1. 固定

1)灌流固定:①脑、心脏等组织:用2.5%戊二醛和4%多聚甲醛混合缓冲固定液对实验动物进行灌流固定;②肝、肺等其他组织:可在腹腔中滴入上述混合固定液后取材;

2)前固定:迅速取出实验组织所需部位,用手术剪或锋利的刀片快速切割为不大于1mm3的组织块,投入2.5% 戊二醛缓冲固定(电镜纯度)中,4℃或室温固定2小时以上;

3)冲洗:缓冲液冲洗3次,每次5-9分钟,水洗1次,7-10分钟;

4)后固定:向样品中加入1%2%四氧化锇固定液进行后固定, 室温或4℃固定1-3小时;

5)冲洗:缓冲液冲洗3次,每次5-9分钟。

2. 脱水

30%——50%——70%——80%——90%——100%——100%酒精对样品进行梯度脱水, 每步20-30分钟,为保证脱水完全,100%酒精重复2-3次。

3. 渗透(根据环氧树脂的品种,严格按配方比例混合并搅拌均匀)

丙酮置换样品中酒精,5-10分钟;

然后进行环氧树脂的渗透,每步比例与时间分别为:

丙酮:环氧树脂= 3:11-3小时(室温)

丙酮:环氧树脂= 1:11-3小时(室温)

丙酮:环氧树脂= 1:33小时-过夜(室温)

环氧树脂 100% 12-24小时(室温)

以上各步都在旋转混合仪上进行摇晃旋转,以加速渗透。

4. 包埋与聚合

1)包埋液的配制:向100%环氧树脂中加入1.5%-2%的催化剂,混合后搅拌20-30分钟;

2)样品的放置:树脂注入包埋模具或胶囊中,再将样品按所需的方位摆放在包埋模具或胶囊的树脂中,样品一定要放置在底部,防止聚合过程中移动;

3)聚合:45℃预聚合12小时,然后60℃聚合24小时。

5. 切片(略)

6. 染色(略)